血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片的构建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.001

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (41): 6561-6566.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.001

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血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片的构建

梁源¹，隋珂^1，2，尚冯青¹，唐丽¹，王阿娴¹，季海宁¹，丁寅¹

¹解放军第四军医大学口腔医院正畸科，军事口腔医学国家重点实验室，陕西省西安市 710032；²解放军空军总医院口腔科，北京市 100036

修回日期:2014-09-04 出版日期:2014-10-01 发布日期:2014-10-01
通讯作者: 丁寅，博士，教授，解放军第四军医大学口腔医院正畸科，军事口腔医学国家重点实验室，陕西省西安市 710032
作者简介:梁源，女，1984年生，山东省蓬莱市人，汉族，2014年解放军第四军医大学博士毕业，医师，主要从事口腔正畸临床与基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81170982)

Construction of endothelial progenitor cells/bone marrow mesenchymal stem cells composite sheets

Liang Yuan¹, Sui Ke^{1, 2}, Shang Feng-qing¹, Tang Li¹, Wang A-xian¹, Ji Hai-ning¹, Ding Yin¹

¹State Key Laboratory of Military Stomatology, Department of Orthodontics, School of Stomatology, the Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; ²Department of Stomatology, Air Force General Hospital, Beijing 100036, China

Revised:2014-09-04 Online:2014-10-01 Published:2014-10-01
Contact: Ding Yin, M.D., Professor, State Key Laboratory of Military Stomatology, Department of Orthodontics, School of Stomatology, the Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
About author:Liang Yuan, Master, Physician, State Key Laboratory of Military Stomatology, Department of Orthodontics, School of Stomatology, the Fourth Military Medical University of PLA, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81170982

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现充足的血供是骨组织修复与再生必不可少的条件。

目的：应用血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞构建出复合细胞膜片。

方法：体外分离培养SD大鼠血管内皮祖细胞及骨髓间充质干细胞，将两种细胞直接共培养，经成膜诱导10 d后构建出复合细胞膜片并对获得的膜片进行大体、倒置显微镜及苏木精-伊红染色观察。将血管内皮祖细胞及骨髓间充质干细胞分别应用荧光标记液标记后，观察膜片诱导过程中两种细胞的分布及交流情况。对复合细胞膜片进行碱性磷酸酶活性检测及茜素红染色，观察其成骨分化能力。

结果与结论：血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞直接共培养成膜诱导10 d后可成功获得复合细胞膜片，两种细胞在成膜诱导过程中存在细胞间接触。获得的膜片由多层细胞及细胞外基质构成，经碱性磷酸酶活性检测及茜素红染色结果证实该膜片具有较强的成骨分化能力，为进一步将血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片应用于骨缺损的修复提供了条件。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 细胞膜片, 骨髓间充质干细胞, 血管内皮祖细胞, 血管化, 直接共培养, 成膜诱导, 细胞外基质, 成骨诱导, 组织工程, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Many studies have showed that enough blood supply is an essential condition of bone repair and regeneration.

OBJECTIVE: To construct the endothelial progenitor cells/bone marrow mesenchymal stem cells (EPCs/BMSCs) composite sheet.

METHODS: After isolation and culture, EPCs and BMSCs were co-cultured directly to form EPCs/BMSCs sheet by cell sheet-inducing medium. After 10 days of induction, the sheet was investigated by gross observation, inverted microscope and hematoxylin-eosin staining. The distribution and communication of EPCs and BMSCs during the process of cell sheet induction were observed after the fluorescence labeling separately. Alkaline phosphatase assay and alizarin red staining were applied to examine the ability of osteogenic differentiation of EPCs/BMSCs sheet.

RESULTS AND CONCLUSION: EPCs/BMSCs sheet was harvested after 10-day induction. Cell-cell contact between EPCs and BMSCs could be observed during the process of the cell sheet preparation. The harvested sheet was composed of multiple layers of cells and cell-produced extracellular matrix. Alkaline phosphatase assay and alizarin red staining both demonstrated that EPCs/BMSCs sheet had good osteogenic differentiation ability. These results suggested that EPCs/BMSCs sheet can be constructed successfully, and the sheet has strong osteogenic differentiation capability in vitro, providing the foundation for the repair of bone defects.

全文链接：

Key words: stem cells, extracellular matrix, tissue engineering

中图分类号:

R394.2

梁源，隋珂，尚冯青，唐丽，王阿娴，季海宁，丁寅. 血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片的构建[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(41): 6561-6566.

Liang Yuan, Sui Ke, Shang Feng-qing, Tang Li, Wang A-xian, Ji Hai-ning, Ding Yin. Construction of endothelial progenitor cells/bone marrow mesenchymal stem cells composite sheets[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(41): 6561-6566.

图/表（结果） 2

2.1 血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片的观察 将血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞直接共培养24 h后，更换培养液为成膜诱导液继续培养，随着成膜诱导时间的延长，细胞数量显著增多，细胞排列越来越紧密，细胞之间界限逐渐模糊(图1A)。诱导第10天，大体可观察到6孔板底壁出现膜状物质，呈现乳白色、半透明状。用细胞刮沿6孔板边缘小心将膜样物质刮起，可完整将其与6孔板底壁分离(图1B)，利用镊子等器械可直接将膜片夹起，获得的膜片可进行折叠或卷曲，具有一定的弹性和机械性能。苏木精-伊红染色结果显示：血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片由多层细胞及细胞外基质组成，膜片中细胞外基质含量丰富且与细胞间排列紧密(图1C)。

2.2 复合细胞膜片构建过程中血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞分布及交流情况 血管内皮祖细胞经DiI标记后呈现红色荧光，骨髓间充质干细胞经DiO标记后呈现绿色荧光。血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞经直接共培养，成膜诱导后，荧光显微镜下观察发现，两种细胞生长情况良好，分布较均匀，两种细胞排列紧密成簇状，可观察到双重荧光染色(呈黄色)现象出现(图2)。此外，应用激光共聚焦显微镜进一步观察发现，两种细胞在直接共培养过程中以某种相对随机的方式有接触现象发生(呈现黄色双荧光染色)，提示两种细胞之间可能存在某种程度的膜交换现象发生(图3)。

2.3 血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片的成骨能力 细胞膜片经成骨诱导7 d后，经碱性磷酸酶活性定量检测发现，血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片碱性磷酸酶的表达活性明显高于单纯骨髓间充质干细胞膜片组(P < 0.05)(图4A)。膜片经成骨诱导14 d后，茜素红染色结果显示：血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片经茜素红染色后可见大量的钙结节形成(图4B)，与单纯骨髓间充质干细胞膜片组比较，钙化结节面积明显增加(P < 0.05)(图4C)，提示复合细胞膜片组钙化能力更高、成骨能力更强。

参考文献

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引言

传统的骨组织工程方法通常应用具有成骨分化能力的种子细胞与生物支架材料在体外复合形成骨组织代替物。细胞膜片技术作为一种新的组织重建方式，自20世纪90年代由日本学者Okano等^[1]首次提出后，便受到很多研究者及临床医生的广泛关注。随着细胞膜片技术的迅速发展，学者们已成功构建出多种细胞膜片^[2]，并在重建心肌组织、角膜及治疗糖尿病和食道溃疡方面取得了深入进展^[3-6]。近年来，细胞膜片技术在骨组织工程方面同样也得到了广泛应用，有学者利用骨髓间充质干细胞构建细胞膜片来修复骨组织缺损。骨髓间充质干细胞在组织工程领域应用十分广泛，是一种在体外易于增殖且可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多个方向诱导分化的多能干细胞^[7-10]。Nakamura等^[11]发现，应用间充质干细胞构建的细胞膜片可明显修复大鼠股骨缺损及骨不连。Ma等^[12]尝试在普通培养皿内构建多层骨髓间充质干细胞膜片来构建较大体积组织工程骨，取得了成功。

移植物植入体内后的血管化问题是骨组织工程中的一个关键问题。移植物植入体内后，其存活所必需的营养及氧气需要足够血供来提供^[13]，在短距离内，物质运输可通过扩散方式交换，但由于这种方式距离上的限制，往往会导致远端出现非细胞生长区^[14-15]。目前，促进骨组织工程血管化的方法包括：体内预血管化骨移植物^[16]，通过增加支架材料的孔隙大小来改良生物支架材料以促进移植物的血管化^[17-18]，添加血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等促血管化生长因子来促进血管化^[19]。此外，有学者提倡采用体外预血管化骨移植物即在构建骨组织工程移植物时将具有成骨分化能力的种子细胞与促血管生成细胞联合培养来促进骨移植物血管化^[20]。

本实验选择具有促血管生成作用的血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞联合培养并构建复合细胞膜片，观察复合细胞膜片中两种细胞的分布及交流情况，并对膜片的体外成骨分化能力进行检测，以期构建出一种可以促进移植物血管化、增强骨组织移植物存活能力、提高种子细胞成骨能力的新型骨组织移植物，为骨组织再生提供新的策略及方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：体外实验，样本观察。

时间及地点：实验于2013年10月至2014年3月在解放军第四军医大学口腔医院颌外创伤实验室完成。

材料：

实验动物：2周龄健康Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠) 20只，体质量40 g左右，雌雄不限，由解放军第四军医大学实验动物中心提供。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离培养：将2周龄SD大鼠脱颈后处死，取股骨及胫骨，α-MEM培养液反复冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，离心，弃上清后重悬，将其缓慢加入装有Percoll分离液的离心管中，2 000 r/min离心20 min，收集中间的单个核细胞层，以获得单个核细胞，PBS洗涤2次后，加入含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液，在37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度条件下培养。48 h后半量换液除去非黏附细胞。此后，每3 d换液1次，当细胞基本铺满培养瓶底后，应用0.25%胰蛋白酶消化，传代。

血管内皮祖细胞的分离培养：将获得的单个核细胞经PBS洗涤2次后，重悬于EGM-2 BulletKit条件培养基中，在37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度条件下培养。48 h后，收集培养瓶内的上清液，将其重悬于EGM-2 BulletKit条件培养基中，每3 d换液1次，待细胞生长至基本铺满培养瓶底时，0.25%胰蛋白酶消化并传代。

骨髓间充质干细胞及血管内皮祖细胞的鉴定：两种细胞的鉴定参照文献[21]的方法进行。

血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片的构建：将原代培养的血管内皮祖细胞与第2代骨髓间充质干细胞消化后，每种细胞按照1.5×10⁵/孔的密度(每孔中细胞总接种密度为3×10⁵)接种到6孔板中，采用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液进行培养。24 h后更换培养液为成膜诱导液(含体积分数为10%胎牛血清，50 mg/L抗坏血酸的α-MEM培养液)，继续在37 ℃、体积分数为5% CO₂饱和湿度条件下培养。每隔3 d换液1次，经10 d的成膜诱导后，用细胞刮沿孔边缘将膜片掀起，以获得完整的细胞膜片。

血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片的组织形态学观察：将获得的细胞膜片用40 g/L多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，常规切片后，采用苏木精-伊红染色，显微镜下观察膜片的组织结构。

血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片构建过程中两种细胞的分布及交流情况：将血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞分别用DiI和DiO荧光标记液标记，以观察复合细胞膜片构建过程中两种细胞的分布及交流情况。将消化后的血管内皮祖细胞及骨髓间充质干细胞分别用PBS洗涤2次，调整细胞浓度至1×10⁹ L^-¹，将细胞重悬于无血清的α-MEM中，1 mL细胞悬液中加入5 μL荧光标记液，吹打均匀后，37 ℃避光孵育20 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清，将细胞重悬于α-MEM中，再洗涤细胞2次(1 500 r/min离心5 min)。将分别标记的血管内皮祖细胞及骨髓间充质干细胞直接共培养后，诱导成膜，应用激光共聚焦显微镜和荧光显微镜观察。

血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片的成骨能力检测：在构建复合细胞膜片的同时，构建单纯骨髓间充质干细胞膜片作为对照组，来比较两种不同膜片的成骨能力。单纯骨髓间充质干细胞膜片的构建方法与复合细胞膜片的构建方法相同，其细胞接种密度为3×10⁵/孔。

将构建好的两组细胞膜片应用成骨诱导液(含体积分数为10%胎牛血清，50 mg/L抗坏血酸，10 mmol/L的β-甘油磷酸钠，10 nmol/L地塞米松的α-MEM培养液)进行成骨诱导，每3 d换液1次，在膜片成骨诱导第7天进行碱性磷酸酶活性定量检测，具体操作步骤参照试剂盒说明书。于成骨诱导第14天，进行茜素红染色，将两组膜片用PBS洗涤2次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，弃去固定液，经PBS洗涤2次后，加入茜素红染液，30 min后弃去染液，PBS洗涤2次，置于显微镜下观察钙结节形成情况。同时应用Image pro plus 6.0软件对钙化结节面积进行定量分析。

主要观察指标：①大体及倒置显微镜下观察血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片的形态及结构。②血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片构建过程中两种细胞的分布及交流情况。③对比观察成骨诱导后不同时间点，血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片与单纯骨髓间充质干细胞膜片的碱性磷酸酶活性、茜素红染色结果。

统计学分析：实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。两组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

细胞膜片技术与传统的应用外源性支架材料方法相比具有很多优势。传统的组织工程方法需要应用胰蛋白酶来消化细胞而后接种到支架材料中，这一过程不仅会导致细胞的大量损失且可影响细胞的活性^[2]。此外，细胞与支架材料直接复合，细胞利用率降低，会导致致密骨组织形成困难。细胞膜片在构建过程中避免了胰蛋白酶的使用，可以在保留细胞自身分泌的细胞外基质的情况下借助细胞间的连接以膜样结构完整获得细胞群。获得的膜片可直接黏附于宿主而无需外源性支架材料的支持，因而可避免外源性支架所引起的非特异性炎症反应及细胞利用率低等问题的发生^[22]。该技术同时还保证了细胞外基质的完整性，其对组织的再生起着相当重要的作用。细胞外基质不仅可调控细胞的黏附、增殖、分化、迁移及死亡，还有着影响组织、细胞结构和功能的作用^[23-24]。此外，细胞膜片因可保护细胞-细胞连接、细胞-细胞外基质连接、生长因子受体及离子通道的完整性，为种子细胞的生存及其作用的发挥提供稳定的微环境^[25]。

血管化在骨组织缺损修复再生过程中起着必不可少的作用。研究发现，在骨再生过程中提供足够的血供，一方面可将成骨及其前体细胞、信号通路相关分子、氧气、营养及经动员参与骨修复再生的相关细胞带入局部微环境中，另一方面可带走组织新陈代谢所产生的废物，从而为骨组织再生提供适宜的微环境^[26]。本实验选择将血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞联合培养，以构建出一种更适合种子细胞生存并促进其发挥成骨作用的骨移植物。血管内皮祖细胞是一类能增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞，最早于1997年由Asahara等^[27]首先从外周血中分离得到。随着日益成熟的分离和扩增技术，血管内皮祖细胞可以较容易的从骨髓或外周血中分离获得。因血管内皮祖细胞体外培养时分化较快，所以细胞多在培养早期进行应用。血管内皮祖细胞不仅参与胚胎时期的血管生成，也参与出生后血管的新生及内皮损伤的修复过程。研究已证实，动员或移植的血管内皮祖细胞可促进局部缺血区域的血管新生，加速损伤血管的修复和再内皮化^[28]。

本实验将骨髓来源的间充质干细胞及血管内皮祖细胞直接共培养后，通过在培养基中添加抗坏血酸来诱导血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片的形成。抗坏血酸具有促进细胞增殖和促进细胞外基质合成的作用^[29]，利用该方法获得的细胞膜片与经典的应用聚合物N-异丙基丙烯酰胺[poly(N-isopropylacrylamide) (PI-PAAm)]等特殊材料获得的膜片相比方法更简单实用^[25]。在本实验中，血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞直接共培养后，经抗坏血酸成膜诱导10 d即可获得复合细胞膜片，该膜片具有一定厚度和机械性能且包含丰富的细胞外基质。直接共培养的骨髓间充质干细胞及血管内皮祖细胞在诱导成膜过程中生长状况良好，两种细胞之间相互接触并融合生长，提示两种细胞之间存在某种程度的相互调控作用，会影响细胞的生长及分化^[30]。本实验进一步对复合细胞膜片的体外成骨能力进行检测，结果发现血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞直接共培养后诱导形成的复合细胞膜片，其成骨能力较单纯骨髓间充质干细胞膜片更强，可能由于血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞的相互作用而促进了骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。

实验成功构建出了血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片，发现血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞相互作用后可提高复合细胞膜片的成骨能力。但两种细胞之间的具体作用机制及复合细胞膜片在体内成骨方面的研究还需进一步完善。随着研究的深入，有理由相信，血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片可为骨组织的修复再生提供新的思路和方法。

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Construction of endothelial progenitor cells/bone marrow mesenchymal stem cells composite sheets

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